Вирусологические исследования
Реакция коагглютинации (РКОА) основана на способности белка А золотистого стафилококка (штамм Cowan 1) соединяться с Fc-фрагментами lg человека. При этом Fab-фрагменты остаются свободными для реакции с гомологичными антигенами.
Основываясь на этом принципе, Мазанкова Л. Н. и Косоротико-ва А. И. внедрили в пpaктику тест твердофазной коагглютинации для индикации ротавирусного антигена в фекалиях больных. В качестве диагностикума использовали микробные клетки стафилококка, обработанные гипериммунной сывороткой против ротавируса обезьян (SA 11). Титр антигена определяли по наибольшему разведению, вызывающему коагглютинацию бактерий, покрытых антителами (на ++) на твердой фазе лунок панелей из полистирола.
Авторы установили специфичность теста при обследовании 410 детей в возрасте от 1 месяца до 14 лет, из которых у 84 (21%) идентифицирована ротавирусная инфекция (Мазанкова Л. Н., Косоротикова А. И., 1989).
Применение РКОА параллельно с ИФА и РАЛ показало близкую корреляцию результатов использованных методов (Zhang Y. et al., 1989 Pereira V. et al., 1992 Jap K. et al., 1992). Однако имеются сведения о появлении неспецифических реакций с копроматериалами, которые можно устранить предварительной адсорбцией взвесью стафилококков.
В то же время, несмотря на совпадение результатов обследования материалов РКОА и ИФА, чувствительность ее и специфичность оказалась ниже, чем у ИФА и сравнима с латекс-агглютинацией (Jap К. et al., 1992).
Таким образом, результаты применения РКОА позволяют рекомендовать ее для диагностики ротавирусной инфекции в лабораториях, где отсутствует возможность использования более чувствительных и специфичных методов. Однако апробированная в последнее время модификация РКОА и радиоиммунопреципитации с использованием белка А золотистого стафилококка позволила значительно повысить чувствительность и специфичность метода и изучить иммунологический ответ к VP2, VP6 и NSP2 в сыворотках и копроматериалах детей с RV инфекцией (Colomina I. et al., 1998).
Реакция агглютинации латекса (РАЛ) применяется в лабораторной пpaктике в связи с усилившейся в последние годы тенденцией использовать в качестве носителей антигенов и антител инертных синтетических материалов. С этой целью используют полистирольные латексы — синтетические глобулы со стандартным размером частиц около 0,8 мкм.
Более мелкие по размеру частицы (0,2-0,3 мкм) оседают в реакциях медленно и требуют ультрацентрифугации в процессе приготовления диагно-стикума, крупные же ( 1 мкм) часто дают неспецифические реакции. Частицы латекса, предварительно адсорбированные антителами (антигенами), приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологического антигена (антитела) и визуализируют специфический комплекс антиген-антитело.
С целью повышения специфичности и чувствительности метода латексные частицы могут быть сенсибилизированы иммуноглобулинами (Amer A. et al., 1990). В связи с простотой и скоростью проведения исследования, а также низкой стоимостью латекс-агглютинация используется в лабораторной пpaктике достаточно широко: Ruggeri F. et al., 1992.
В настоящее время налажен выпуск коммерческих тест-систем для латекс-агглютинации, что послужило основанием для проведения работ по сравнительной оценке их диагностической эффективности.
Обобщенные результаты оценки РЛА и других лабораторных методов обнаружили, что показатели чувствительности и специфичности РЛА по сравнению с ПЭМ, ИФА, ЭФ в ПААГ были достаточно высоки и равнялись 70-96% и 80-100% соот-ветствено (Santos N. et al., 1989 Molyneaux P. J. et al., 1989 Amer A. et al., 1990 Hendricks M. K. et al., 1995). Применение моноклональных антител еще более повышало диагностическую ценность РЛА (Dennehy Р. et al., 1988 Zbinden R. et al., 1992 Sanchez R. et al., 1993).
Наряду с коммерческими латекс-системами исследователи применяют и лабораторные тесты, которые дают сопоставимые с ними результаты (Amer A. et al., 1990).
В то же время ряд авторов указывали на то, что применение РЛА не лишено недостатков, так как дает определенное число ложных результатов. Так, при обследовании 200 больных детей методами ИФА и РЛА выявлено 11 ложнонегативных проб при показателях чувствительности и специфичности равных 86 и 95% соответственно (Amer A. et al., 1990).
Позднее другие авторы при обследовании 585 проб стула больных детей методом РЛА и ЭФ в ПААГ получили показатели чувствительности и специфичности равные 96 и 100% соответственно. При этом обнаружено 6 ложноотрицательных и 3 ложноположительных результата в отличие от ЭФ в nAAT.(Zbinden R. et al. 1992).
По данным Hendricks М. К. et al. обследование 103 детей в возрасте от 1 месяца до 5 лет методами ПЭМ, ЭФ в ПААГ и РЛА показало, что чувствительность этих методов равнялась 84, 90 и 80%, а специфичность 100, 100 и 81% соответственно. Авторы обнаружили 15% ложноположительных результатов по данным РЛА (Hendricks М. К. et al., 1995), что может быть связано при рота-вирусном гастроэнтерите с наличием крови в исследуемом материале.
В связи с этим при получении положительных реакций в РЛА с образцами, содержащими кровь, результаты следует интерпретировать с осторожностью и подтверждать другими методами (Bendall R. et al., 1991).
Таким образом, РЛА представляет собой наиболее простую диагностическую реакцию обнаружения ротавирусов. Являясь ценным методом экспресс-диагностики и обладая высокими показателями чувствительности и специфичности, этот метод, однако, не имеет никаких преимуществ перед ИФА, ПЭМ, ЭФ в ПААГ, кроме скорости проведения реакции, и нуждается в подтверждении другими методами.
Резюмируя материалы, следует отметить, что в целом осадочные тесты находят широкое применение в лабораторной диагностике ротавирусной инфекции в связи с высокой чувствительностью и скоростью получения результатов, простотой постановки и учета, а также отсутствием необходимости использования сложного оборудования и дорогостоящих реагентов.
Диагностические методы, основанные на выявлении вирус-специфических РНК. Разработка молекулярно-биологических методов в вирусологии привела к внедрению в пpaктику ряда новых диагностических тестов, основанных на выявлении вирусных РНК.
Их использование открыло возможность подхода к молекулярной эпидемиологии и позволило решить некоторые вопросы таксономии ротавирусов. Одним из первых диагностических методов этой группы стал электрофорез вирусного генома в геле.
Электрофорез вирусных РНК в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) достаточно универсален и широко распространен как в научно-исследовательских, так и пpaктических лабораториях. Благодаря своей высокой специфичности и чувствительности он позволяет решать целый комплекс проблем, связанных с ротавирусной инфекцией, и находит применение в диагностике, эпидемиологии и профилактике.
Возможность применения этого метода обусловлена уникальным хаpaктером распределения в геле одиннадцати сегментов вирусного генома и большой устойчивостью ротавирусной РНК к действию факторов окружающей среды. Существует несколько модификаций проведения ЭФ в ПААГ.
Незначительно отличаясь друг от друга, все они основаны на экстpaкции РНК ротавирусов, разгонке выделенных РНК в полиакриламидном геле под воздействием электрического поля и визуализации результатов разгонки РНК вирусного генома. Изменения могут быть на каждом из этих этапов проведения ЭФ в ПААГ. Так, выделение РНК ротавируса может проводиться непосредственно из фекалий, минуя стадию получения очищенного вируса возможно предварительное разделение одно- и двунитчатых РНК, введение метки 32Р, обработка исследуемого материала нуклеазой S1, разрушающей однонитчатые РНК структуры варьирует состав буферных растворов, процентное содержание разделяющего и концентрирующего геля сила тока при электрофорезе, методы окраски.
Время проведения исследования составляет 24-36 часов. В результате на полосах геля после его окраски нитратом серебра или этидиум-броми-дом выявляются профили вирусной РНК, соответствующие 11 сегментам генома вируса (Unicomb L. Е. et al., 1993 Assouli S. M. et al., 1995 Bos P. et al., 1995 Васильев Б. Я. и др., 1995 Szczepaniak Z. et al., 1996 Holmes J. H., 1996 Steele A. D. et al., 1996 Markowska-Daniel J. et al., 1996 Espinoza F. et al., 1997 Adah M. et al., 1997 Wu H. et al., 1998).
При соблюдении стандартности условий проведения электрофореза расположение сегментов генома достаточно стабильно и позволяет идентифицировать изолят на основе индивидуальности его фореграммы. Следует отметить, что хаpaктер распределения сегментов генома на фореграмме является генетически устойчивым признаком, и любые изменения в аминокислотной последовательности генома влекут за собой изменение скорости миграции вирусных белков (Kuzuya М. et al., 1996).
Более того, хаpaктер фореграммы, присущей определенному изоляту, может служить в качестве инструмента для расшифровки вспышек, выявления путей и источников заражения (Oishi J. et al., 1993 Broor S. et al., 1993 Beque R. et al., 1992). К тому же, именно этот метод позволил разделить ротавирусы на две подгруппы с так называемыми «короткими» или «длинными» фо-ретипами (обусловленными меньшей или большей подвижностью 10 и 11 сегментов генома), что имеет принципиальное значение для классификации RV популяции.
Следовательно, ЭФ в ПААГ может быть с успехом использован в диагностике, эпидемиологии, классификации и по отношению к целому ряду методик (РАЛ, ГА, выделение вируса на культуре клеток) — референс -методом.
Исследования, проведенные рядом авторских коллективов, показали, что ЭФ в ПААГ обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Сравнительное изучение этих параметров применительно ЭФ в ПААГ, ПЭМ и РЛА, проведенное при обследовании 103 детей, показало, что чувствительность составляла 90, 84 и 80%, а специфичность 100, 100 и 81% (Hendricks М. К. et al., 1995).
Аналогичные данные, с привлечением помимо указанных методов еще и ПЦР и ИФА получены Buesa J. и Husain М. Правда, чувствительность ЭФ в ПААГ, по данным этих авторов, несколько уступает результатам ПЦР и ИФА, однако специфичность составляет 100% (Husain М. et al., 1995 Buesa J. et al., 1996). Подобные результаты получены и нами при исследовании фекалий от 50 больных ОКЗ методами ПЭМ, ИФА и ЭФ в ПААГ. Показатели положительных находок в ЭФ в ПААГ составили 28% против 35% в ИФА и ПЭМ.
Однако следует отметить, что в трех пробах, где ротавирусы в ПЭМ обнаружены не были, по данным ЭФ в ПААГ зафиксирована фореграмма, хаpaктерная для ротавируса (Васильев Б. Я. и др. 1990). Более поздние наши исследования, проведенные на материале 510 больных ОКЗ с использованием ИФА, ПЭМ и ЭФ в ПААГ, позволили нам подтвердить ротави-русную этиологию заболевания в 37 и 23% соответственно (Васильев Б. Я. и др.
1995).
Maldonado A. et al. (1998) при сравнительном исследовании копроматериалов детей, госпитализированных с диареей, методами ЭФ в ПААГ и ИФА документировал RV природу заболеваний в 42,7 и 49,5% соответственно.
Необходимо отметить, что помимо горизонтального применяется и вертикальный электрофорез, который, по мнению ряда авторов, сопоставим с горизонтальным по специфичности и чувствительности, но более прост. При его проведении для визуализации результата авторы предлагают включать бромистый эти-дий непосредственно в гель и использовать один и тот же гель для нескольких исследований.
Ими также было сконструировано устройство с ультрафиолетовой подсветкой, позволяющее легко и удобно читать фореграммы (Zbinden R. et al., 1992).
Модификацию вертикального электрофореза с визуализацией фореграмм методом серебрения предложили Giardano М. О. et al. (1997). Полученные ими данные показали, что новая модификация чувствительнее, специфичнее и дешевле, чем общепринятый ЭФ в ПААГ.
Таким образом, метод ЭФ в ПААГ в настоящее время нашел широкое применение в лабораториях разных стран для диагностики RV. Многочисленные сравнительные испытания этого метода с ПЭМ, ИЭМ, РАЛ и ИФА свидетельствуют о его высокой специфичности и чувствительности, а также возможности применения ЭФ в ПААГ в качестве референс-метода при изучении новых тест-систем.
Использование электрофореза в полиакриламидном геле с целью выявления источников инфекции и путей ее распространения, а также расшифровки этиологии эпидемических вспышек явилось основой для успешного решения актуальных вопросов молекулярной эпидемиологии.
Процесс переноса белков (Western-blot) или нуклеиновых кислот (Dot-blot или Northern-blot и Southern-blot) из электрофоретической матрицы и их иммобилизация на поверхности твердой фазы называется блотингом, а полученный отпечаток — блотом. При анализе блотограмм с помощью иммунных сывороток метод называют иммуноблотингом.
В качестве зондов обычно используют либо РНК, трaнcкрибированные in vitro на матрице вирусного генома, либо клоны комплементарной ДНК, полученной на матрице вирусного генома с использованием обратной трaнcкриптазы и последующим молекулярным клонированием. Ранее метку зондов осуществляли изотопами 125J или 32Р, но в последние годы применяют нерадиоактивные метки — биотин или ферменты (щелочная фосфатаза, пероксидаза и др.), что существенно упрощает метод, поскольку снимает вопросы изотопной безопасности.
В этом случае результаты реакции фиксируются в виде цветовых пятен, образующихся под воздействием фермента на добавляемый субстрат, что свидетельствует о гибридизации зонда с РНК вируса в исследуемом материале.
ru рассказывает, как и почему знаменитости оставляют свою карьеру или ставят ее на продолжительную паузу...
13 05 2024 20:37:52
Женская форма имени – Фарида...
12 05 2024 10:46:58
И только выполнение родителями обязанности содержать своих детей гарантируется государством под угрозой уголовной ответственности...
11 05 2024 7:12:34
Теперь мы выросли, и самое время взглянуть на них по-новому, чтобы насладиться полетом авторской фантазии...
10 05 2024 16:16:25
Дословно переводилось «охранять имя Бога»...
09 05 2024 11:57:35
Новый отчет направляется в центр занятости с 1 октября 2020 года в ежеквартальном режиме — что в нем должно содержаться, является ли этот отчет обязательным...
07 05 2024 11:33:24
А потом они становятся основой для замечательных фильмов...
06 05 2024 13:12:16
Но на 2016 год наше государство столкнулось с некоторыми проблемами, и власти даже при всем желании не могут увеличивать социальные выплаты гражданам так, как это положено по законодательству...
05 05 2024 20:47:17
Поэтому при возникновении ощущений дискомфорта и недомогания так важно определить истинную причину, почему болит горло, а для этого лучше обратиться к доктору, не занимаясь самолечением...
04 05 2024 5:29:50
Средняя зарплата в ГерманииПо сведениям Федерального статистического управления, средняя зарплата в Германии в 2019 году составляет 3 771 евро в месяц до уплаты налогов (брутто)...
03 05 2024 13:40:32
Тем более что эта морская принцесса так нравится юным леди...
02 05 2024 18:29:19
В итоге основные льготы вернули в натуральном виде, но часть льгот можно получать в денежном выражении, написав соответствующее заявление...
01 05 2024 18:33:14
На новогодний праздник в костюмах стало ходить не совсем модно...
30 04 2024 5:46:17
Содержание статьи:Наиболее благоприятными периодами станут весенние месяцы, затем июль – август и концовка года...
29 04 2024 0:27:16
Дeвyшке еще на свадьбе завязывали на шее шерстяную нить...
28 04 2024 22:28:42
Специалист разъяснит соискателям алгоритм действий при оформлении заграничного паспорта, даст эффективные советы и рекомендации, расскажет, как оплатить госпошлину за загранпаспорт с 5-ти и 10-летним сроком действия через Сбербанк...
27 04 2024 7:31:39
Тем более что к такому увлекательному процессу можно привлечь семью и друзей...
26 04 2024 17:31:39
Естественно, в таком огромном выборе немудрено и запутаться...
25 04 2024 2:11:11
Именно эти войска являются элитной частью российской армии, которой должна гордиться страна...
24 04 2024 15:19:23
Поэтому с бизнес-партнером придется делить прибыль, которую будет приносить ваше дело...
23 04 2024 12:46:16
Перед тем как принять решение, нужно посоветоваться с агентами страховых компаний...
22 04 2024 10:22:22
Что такое микрозаймыКак и обычные кредиты от банков, микрозаймы – это денежные средства, предоставляемые на ограниченное время, и под определенную плату...
21 04 2024 19:18:36
Мир пододеялья в такие минуты особенно притягателен и безграничен...
20 04 2024 5:25:17
Пятиглавая громада собора стоит в Верхнем городе, на возвышении Тоомпеа и служит прекрасным ориентиром, а вечером здание красиво подсвечивают...
19 04 2024 18:23:44
Оно имеет важнейшее значение, так как сапфир представляет собой один из самых прочных и дорогих камней на планете...
18 04 2024 8:54:31
Почему? Всё предельно просто, из-за того, что они перевозятся на машинах, а те в свою очередь работают на бензине и ДТ...
17 04 2024 0:57:21
ru приоткроет завесу тайны и покажет вам 8 фактов, после которых вы начнете по-другому смотреть на представителей сильного пола...
16 04 2024 21:52:10
1EВ 1,5 км от устья Псковы, на правобережье реки возвышается округлая башня с бойницами...
15 04 2024 18:59:19
14 04 2024 21:56:38
Этим термином обозначают коллекцию образцов искусства и архитектуры на плитах из камня...
13 04 2024 22:35:56
Но сложнее всего приучить ребёнка к чтению...
12 04 2024 15:44:45
ru решили разложить все по полочкам и понять, как одеваться правильно, с точки зрения гуру стиля...
11 04 2024 20:10:52
Общая хаpaктеристикаЧтобы понять, насколько благоприятной будет совместимость в паре Дpaкона и Лошади, стоит проанализировать хаpaктеры обоих партнеров...
10 04 2024 17:37:13
Общий гороскоп знака Козерог на годВполне вероятно, что следующий год будет для Вас хорошей возможностью значительно преуспеть как в личной, так и в профессиональной сферах деятельности...
09 04 2024 7:42:29
08 04 2024 4:54:13
Сегодня ученые активно изучают его свойства и влияние на организм человека...
07 04 2024 6:58:53
Также точно избранные тени внесут в ваши глаза необыкновенную выразительность...
06 04 2024 17:53:24
Содержание статьи:Основные правила выбора платья• Фасоны платьев для полных женщин со смещённой вверх линией талии переносят акцент с талии на гpyдь...
05 04 2024 14:34:20
Поздравляя с ним родных и близких, не забудьте обнять их и сказать, как сильно вы их любите...
04 04 2024 8:47:42
Люди обычно с трудом распознают в себе эти опасения, потому что одновременно с ним они хотят отношений — романтических или даже просто дружеских...
03 04 2024 5:11:58
02 04 2024 23:29:18
День ангела Леониды : Имя Леонида один раз в году отмечает именины: 8 июля (25 июня) – Преподобномученица Леонида и ее подруги пострадали за Христа в 310 г...
01 04 2024 13:49:28
ru разыскал 6 приемов, чтобы привить ребенку любовь к чтению с самого раннего детства...
31 03 2024 12:52:36
Выплаты за неиспользованные медицинскую услуги по полису ОМС не существуют — имейте это в виду и предупредите об этом родственников, особенно пенсионеров!Суть мошенничества с выплатами за неиспользованные услуги по медицинскому полису ОМСВ начале этого года в российском интернете появилось сразу несколько мошеннических сайтов, работающих по одной и той же схеме...
30 03 2024 20:17:54
Кашель представляет собой защитную реакцию, с помощью которой организм отвечает на проникновение в дыхательные пути различных микробов, аллергенов или инородного тела...
29 03 2024 11:54:29
Будет интересно!Какой ваш китайский знак Зодиака?Китайский зодиак (с китайского «Шэн сяо» фактически переводится как «похожий на рождение»)...
28 03 2024 17:35:57
Позы для фотосессии с любимым могут быть различными...
27 03 2024 5:53:51
Стеклянные лаконичные вазы, стилизованные колбочки от лампочек или даже обычные бутылочки — всё это может быть украшено свежими цветами...
26 03 2024 11:12:39
В качестве Person человек стоит как бы на двух ногах: с одной стороны, он находится внутри себя, с другой стороны, он интенционально направлен на другого или на других...
25 03 2024 22:13:54
Еще:
законы -1 :: законы -2 :: законы -3 :: законы -4 :: законы -5 :: законы -6 :: законы -7 :: законы -8 :: законы -9 :: законы -10 :: законы -11 :: законы -12 :: законы -13 :: законы -14 :: законы -15 :: законы -16 :: законы -17 :: законы -18 :: законы -19 :: законы -20 :: законы -21 :: законы -22 :: законы -23 :: законы -24 :: законы -25 :: законы -26 :: законы -27 :: законы -28 :: законы -29 :: законы -30 :: законы -31 :: законы -32 :: законы -33 :: законы -34 :: законы -35 :: законы -36 :: законы -37 ::